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大健康
作者:天府健谈组委会
2021-10-27 15:56
[亿欧导读]

自从去年9月份推出的第一款纳米孔单分子测序仪以来,到目前为止齐碳已经和国内的几十家精准医疗企业、30多家高校和科研院所开展了合作测试。

齐碳科技

题图来自“原创图片”

10月11日-13日,“天府健谈·CHS 2021第六届中国大健康产业升级峰会”正式召开。本届峰会由中国卫生信息与健康医疗大数据学会全科医学与健康管理工作委员会、亿欧EqualOcean主办,四川省卫生健康委、中国卫生信息与健康医疗大数据学会指导,中国卫生信息与健康医疗大数据学会三医联动健康保障分会、健康保险工作委员会、信息及应用安全防护分会协办,成都市卫生健康委支持,亿欧大健康承办。

中国大健康产业升级峰会已成功举办了5届,本届峰会以“集成创新·引领产业融合”为主题,围绕数字医疗、AI和计算驱动的新药研发、基层医疗、支付创新、基因检测、中医康养、智慧养老七大细分领域的市场环境、投资热点和产业变革等话题展开探讨,共包括1场开幕式、7场产业论坛、1场晚宴盛典、3天产业创新展、1场创新项目路演、1场院长培训班。

在10月13日的基因检测产业论坛上,齐碳科技产品中心总监杨志博士发表了“国产四代测序仪在临床研究中的应用探索”的演讲。他的核心观点如下:

1. 纳米孔单分子基因测序仪由于原理不同,本身不需要像二代测序仪那样拥有复杂且大型的光学成像系统,也不需要复杂的液路系统,所以它可以做到非常小巧便捷,成本也远低于二代测序仪,可以非常灵活地适用于各个应用场景。

2. 随着新冠疫情爆发,感染性疾病诊断在这两年已经成为测序技术的新战场。纳米孔单分子测序技术具备的长读长、小巧便携和实时测序实时分析的优势,特别适用于病原微生物快检领域。

以下为其演讲全文(在不改变原意的基础上略有删改):

谢谢大会的邀请,今天非常开心有机会在这里和大家分享齐碳科技国产第四代纳米孔单分子测序仪的产品研发进展,以及我们目前在临床上的一些应用探索。

今天在会议上,包括平时大家都经常听到一个词——精准医疗。而精准医疗的实现有一个非常核心的技术,就是基因测序。在过去的20多年间,基因测序技术有了非常大的发展,从一开始的以Sanger测序为代表的第一代测序技术,到后面二代测序技术广泛使用,再到现在从2010年左右开始出现的第三代和第四代的基因测序技术,已经可以实现对单分子进行连续测序。目前来讲,我们更习惯于把PacBio的测序技术SMRT技术称为第三代,把纳米孔测序称为第四代,因为它们在测序原理上是有本质区别的。

刚才的各位嘉宾都讲了二代测序在临床应用当中占据了非常大的比重,包括在生殖健康、肿瘤研究、遗传病诊断方面都发挥了重要作用。总体讲还是因为二代测序高通量和高准确度的优点,大大降低了单位数据量的测序成本。不过,二代测序的缺点也明显——测序读长短,测序时间长,开机成本高,对于一些大基因组层面的结构变异问题很难去解决。

还有落地问题,对于二代测序来讲,它本身单位数据量的成本是比较低的,但每一次运行的成本却相对还是比较高,而且应用到临床上时,正常是需要凑到一定的数据量才能达到一次上机要求,同时运行一次一般也需要几天的时间。因此,在临床上对时效性要求很高的应用场景,比如最近很火的病原微生物检测方向就有很大的局限,没有办法做到病例的随到随检和非常极速地出结果。

正是因为二代测序有了上述缺点,后面陆续出来了一些单分子测序技术,这里面主要提一下纳米孔单分子测序方法。实际上它是对一个多孔电流信号进行检测,因此这个仪器本身不需要像二代测序那样拥有复杂且大型的光学成像系统,也不需要复杂的液路系统,所以它可以做到非常小巧便捷,仪器成本也远低于二代测序的仪器,可以非常灵活地适用于多个应用场景。

齐碳科技是一家专注于纳米孔基因测序仪和配套试剂、芯片耗材研发、生产和应用开发的高科技企业。我们是中国第一家也是目前为止世界上第二家成功将纳米孔单分子测序技术产品化的公司。

齐碳科技成立于2016年,注册在成都的高新区,2018年在北京成立了全资子公司,发展到目前为止公司的员工有200余人,超过一半以上都是硕博的学历,200余人里面70%以上都是研发人员,所以我们的研发能力非常强。

2017年和2018年,齐碳科技相继研发出纳米孔测序仪的原理样机和工程样机,并在去年9月份成功地推出了国内首款纳米孔单分子测序仪QNome-9604。按照规划,今年第四季度,公司位于成都的GMP工厂就会建成转产。

这是我们在去年9月份发布的第一台国产纳米孔单分子测序仪,最初仪器测序的单次准确率是在85%。通过我们不断地迭代技术,目前已经可以做到单次90%以上的准确率。

通量方面,对于标准的文库,我们8个小时可以稳定产出500Mb数据,读长大于10kb。其实,纳米孔单分子测序仪的原理非常简单,比如说我和主持人分别站在门口,拿一个电风扇往外吹风。实际上吹出的风量是不一样的,纳米孔单分子测序仪的原理便是如此——我们在一个单分子的膜上嵌上一个生物纳米孔,在电场力的作用下,单链的核酸分子通过纳米孔道时会对过孔电流产生一定的干扰,核酸上不同的碱基在过孔的时候产生的干扰电流特征是不一样的。这样的话,我们通过记录这些干扰电流的特征就可以去反向推导出碱基信息。

大家知道有很多东西原理很简单,但真正做起来还是很难的。纳米孔单分子测序的工作原理决定了它的技术特点,最典型的就是它的读长可以做到非常长。纳米孔单分子测序的读长限制并不在于测序仪本身,而在于前期的样本制备和文库构建,所以理论上来讲,文库做到多长就可以测到多长。

同时它的文库制备流程相对比较简便,测试数据可以实时产出实时分析。不像二代测序,可能要做几十个几百个PCR cycle以后,把拍摄的荧光照片放在一起做碱基识别。我们是可以出一条序列就拿去做分析。对一些时效性要求非常高的场景,比如说像一些未知的病原感染,纳米孔单分子测序技术本身就有了先天优势。

另外,纳米孔单分子测序技术还有一个比较大的优势。由于它能对DNA、RNA甚至是蛋白多肽进行持续测序,所以它可以直接测到DNA、RNA上面的一些修饰,比如一些甲基化的修饰。从原理上来说,碱基但凡有差异,在电流上就会表现出不同的特点,因此纳米孔单分子测序技术本身具有着非凡的前景。

通过前期的潜心积累,齐碳科技在整个纳米孔单分子测序仪的研发过程中已经掌握了所有的核心技术,实现完全自主可控,包括前沿蛋白质结构研究技术,纳米孔单分子测序里面有两个非常关键的蛋白,一个是孔蛋白,它直接决定了碱基读取的分辨率,也就是说不同的碱基过孔的时候,电流跳变的程度越高碱基的区分能力会越强。

另外一个非常重要的酶,马达蛋白,这两种蛋白是在纳米孔单分子测序里处于非常核心的位置。其次就是信号检测电路和流体芯片的设计加工,最后是碱基识别,从电信号转换成碱基信号的测试软件算法等。

正是这些核心能力成功保证了我们在去年成功产品化国产首台纳米孔单分子测序仪,由于测序仪的推出,齐碳科技也成功入选《麻省理工科技评论》评选的“50家聪明公司”。

自去年9月份我们推出第一款测试仪产品后,齐碳也启动了Alpha test项目,携手国内的一些有意愿合作的公司、高校、科研机构,去探究我们的产品到底能够在什么样的领域解决什么样的实际问题。

下面我主要分享一下跟临床感染相关领域的一些案例。

首先我们测了一个大肠杆菌的模式菌株,我们最开始做这个测试的目的,为了测试一下测序仪的测序性能和基因组组装效果。还有一个很重要原因,选择这个应用方向是因为在临床上分离出来的很多耐药菌,它的耐药机制有很多都是在DNA层面上发生的,比如说可能会有一些DNA的突变,基因的拷贝数变异,甚至倒位、异位。一个完整的基因组图谱、一个完整的基因组序列是这些耐药机制研究的分子基础,所以我们觉得这个东西很重要,我们第一款仪器是属于低通量,它的通量对于几个兆的细菌来讲,基因组装是非常合适的。

我们也做了模式菌的测序和组装,结果显示我们仪器的测序性能是没有问题的,也得到了基因组完成图。随后我们拿了一个临床分离的耐药菌进行了相同流程的测试,最后也成功拿到了一个完整基因图谱的数据,并且在组装了以后我们发现它的基因组里面有大量的结构变异,这些结构变异用二代测序的数据基本上没法解决。

随着新冠疫情的爆发,最近这两年测序技术在感染性疾病的诊断领域势头已经渐渐和肿瘤平起平坐,这是现在测序技术的一个新战场。

纳米孔单分子测序仪本身有长读长和快速测序的优势,同时它的结果可以实时输出和实时分析,所以我们觉得这种技术是特别适用于病原微生物快检领域。我们也是先拿了一个多重PCR的panel测试了自己平台数据,同时委托测了MinION平台数据,然后看对测试数据的拆分,从而鉴定结果的一致性到底怎么样。

结果显示,对于病原微生物鉴定,这两个平台在数据的拆分和物种的比对上结果是基本一致的,这也是从一定程度上说明我们的平台是可以用于做鉴定。

现在更主流的病原微生物快检是做宏基因组,我们也开发了一套宏基因组病原快检的方案,这里面包括一个样本的去人源处理,后面的建库和测序分析以及数据比对。我们从样本处理到建库可以控制在4个小时内完成。

起初我们也是用了一个混合了细菌的标准临床血样进行了性能验证。实际上对于感染来讲,全血样本是难度最高的,因为它的人源背景相对来说是最大的。我们用模拟血样去做了自己的流程,结合我们自己的纳米孔单分子测序技术,同时我们也用相同的样本,与现在主流的mNGS数据做了一个对比。

严格来说我们这个数据的呈现方式是有问题的,因为我们二代的数据是测了几十兆的reads,在我们的平台上只测了200到300兆的base。实际上,我们建库的方法,最终文库的平均长度大概在1Kb多,相当于我们自己的平台只测了20万条左右的reads,跟二代测序的reads数相差了几个数量级,我们展示的自己的数据都是经过换算的,展示的是mNGS常用的RPM,也就是reads per million,我们的测试数据相对于二代来讲,检出率这部分的敏感性是大大提高的。

我们认为原因是因为mNGS为了加快检测时间,通常只测几十个bp的reads。但只有几十个bp长的rads,去做物种比对鉴定的话,是很难比对到特异性足够高,能够判断这个物种来源的区域。

而我们自己的纳米孔平台,我们的测序reads数虽然没有二代高,但是reads的平均长度大概有1K多,它的长度在很大程度上就可以弥补准确率的不足,在物种的特异性比对鉴定方面有非常大的优势。

后面我们也做了一例实际的临床样本。这是来源于临床发热的样本,它的血培养是阴性的,非常幸运的是,根据自己的临床经验判断这个病人可能是克雷伯菌特异病感染,并依照此进行了治疗,最后这个病人病情也确实得到了好转。

这个样本拿给我们测试,发现在所有测序的数据里面,差不多检到了21%左右的产气克雷伯菌,人源的比例同时降低到69%左右,和临床的表现是一致的。

另外,我们也做了5例下呼吸道的样本,这五例样本的检测结果和临床培养的结果是高度一致的,同时在2号样本里面,我们自己还测到了铜绿假单胞菌,但是这个菌在临床培养上并没有培养出来,我们也是对原始样本进行了qPCR验证,最后显示这个结果是阳性的。说明我们的方法流程可以为临床诊断提供更多的信息。

除了感染领域,我们觉得长读长的优势在肿瘤领域也可以有一些作为,比如说融合基因的检测,特别是在血液肿瘤里面,相同的一个下游基因可能有多个上游融合的基因,而不同的上游基因往往也预示着病人不同的预后。所以我们觉得从临床上讲,把上游的融合基因确定清楚实际上对临床有非常大的指导意义。

我们也是基于此开发了融合基因的捕获和测序技术,用标准品去做测试,一张芯片的数据差不多可以定性检出0.5%的融合。现在我们将融合基因检测的方向放在了RNA水平,希望用全长转录组的方法配合纳米孔测序更加快速全面的发现融合基因。

自从去年9月份推出的第一款纳米孔单分子测序仪以来,到目前为止齐碳已经和国内的几十家精准医疗企业、30多家高校和科研院所开展了合作测试,我们的公众号正在陆续推出一些应用的案例。

我们始终坚信纳米孔单分子测序技术将来是可以应用到医疗健康和非医疗健康的各个领域,希望用国人自己知识产权转化的产品去回馈社会,去造福大众。

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