走在新一代免疫细胞疗法路上,通用型CAR-T面临安全挑战

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At.Zhou
2018-03-30 · 08:01
[ 亿欧导读 ] 2017年被称为细胞免疫治疗元年,Novartis的CAR-T产品Kymriah和Kite的产品Yescarta的获批上市,而CAR-T与基因编辑合作,其碰撞的火花将会促进新一代细胞免疫治疗的发展。
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在今年2月23号,Gilead旗下公司Kite与Sangamo Therapeutics达成全球合作,使用Sangamo的锌指核酸酶ZNFs技术平台开发下一代肿瘤学离体细胞治疗。根据协议的条款,Sangamo将获得1.5亿美元的预付款,并有资格获得高达30.1亿美元的潜在付款。

这并不是CAR-T与基因编辑的第一次合作,早在2015年1月,Novartis宣布与Intellia Therapeutics展开一项长达5年的研发合作计划,主要致力于加速发展CRISPR/Cas9技术在CAR-T细胞治疗的应用;同年5月,Juno与Editas签订了一项为期三年的合作协议,将借助Editas公司开发的CRISPR/Cas9技术辅助公司现在开发的CAR-T疗法和TCR疗法治疗更多类型的肿瘤类型,这项协议包括了4700万美元预付款和6亿9千万美元的里程碑奖金。

2017年可以被称为细胞免疫治疗元年,Novartis的CAR-T产品Kymriah和Kite的产品Yescarta的获批上市,极大地推动了细胞免疫治疗研发的热情,而CAR-T与基因编辑合作,其碰撞的火花将会促进新一代细胞免疫治疗的发展。

现在绝大多数的CAR-T临床实验都是使用的自体型CAR-T,但是病人自身的T细胞通常都存在质量与数量的缺陷;且自体型CAR-T的生产成本更加昂贵,大约为通用型CAR-T的五倍;自体型CAR-T需要私人定制,而通用型CAR-T能够做到现货供应(off-the-sheff),节约时间。

然而异体型T细胞上的抗原受体TCR可能会识别接受者体内的异体抗原,从而引发移植物抗宿主病(GVHD);此外,异体T细胞上的HLA表达也会迅速地引起宿主免疫细胞排斥反应。因此使用ZFNs,TALENs以及CRISPR/Cas9等基因编辑工具,敲除异体T细胞上的TCR,MHC以及相关信号通路基因,从而防止异体型CAR-T的宿主排斥反应,是实现通用型CAR-T的关键一步。此外敲除PD1与CTLA4等T细胞抑制信号分子,能够进一步增强CAR-T细胞的功能。

此次与Kite达成合作的Sangamo是ZFNs技术的专利拥有者,Sangamo目前有多项使用ZFNs基因编辑治疗罕见病临床试验正在进行中。Editas Therapeutics与Intellia Therapeutics则是基因编辑技术CRISPR/Cas9的领跑者,其创始人分别为学术大牛张峰和Jennifer Doudna。而走在通用型CAR-T研发最前沿的是法国公司Cellectis,其利用自身Talens技术平台研发的UCART已处于临床阶段。本文将主要介绍UCART的产品和生产过程,以及CRISPR/Cas9技术用于编辑CART细胞的最新进展。

UCART产品介绍

UCART与自体型CAR-T有一些共同特征:它们都由慢病毒转染从而携带识别肿瘤上特定抗原的嵌合抗原受体CAR;它们通过CAR识别肿瘤细胞从而发挥杀伤作用。UCART的独特点在于原材料是健康捐献者的血液,并不依赖于病人的淋巴细胞;并非定制的细胞疗法,而是能够现货供应,为更多的病人提供治疗;UCART通过TALEN基因编辑技术,敲除TCR等相关基因,避免移植物抗宿主病,敲除PD1等免疫检查点,进一步增强CAR-T细胞的功能。

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Cellectis公司UCART简介

目前Cellectis公司有两款UCART产品正处于临床实验阶段,UCART19和UCART123。其中UCART19携带靶向CD19的CAR,主要用于治疗急性淋巴白血病(ALL);UCART123携带靶向CD123的CAR,CD123主要在急性髓细胞性白血病(AML)以及BPDCN的白血病细胞上表达。

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UCART19和UCART123

UCART19和UCART123都采用的是第二代CARs,使用了鼠源的scFV,含有41BB和CD3ζ两个共激活结构域;此外在CAR上还添加了一个RQR8基因,RQR8是一个136aa的蛋白,它能够被CD34的抗体QBEnd10识别,因此能够通过Miltenyi CliniMACS的CD34筛选系统进行临床级别的分选;此外RQR8还含有两个利妥昔单抗的模拟表位,能够在发生安全问题时,通过利妥昔单抗迅速清除CAR-T细胞。

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UCART的CAR构建设计

此外,对于UCART19和UCART123,它们都是用了TALEN技术敲除了TRAC基因,从而降低了移植物抗宿主病的风险。在UCART19中还额外敲除了CD52基因,由于在注射UCART19细胞前,急性淋巴细胞白血病ALL患者通常需要接受淋巴细胞耗竭的化疗与anti-CD52(alemtuzumab)血清疗法,因此UCART中敲除CD52基因能够避免UCART产品受到alemtuzumab的影响。

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UCART19 TALEN设计与TALEN转染后蛋白表达水平

UCART GMP生产过程

UCART的生产过程与自体CART大体上类似,不同点在于UCART的原材料是健康捐献者的血液而非病人自身的血液,其次UCART生产过程中多了一步,引入基因编辑工具敲除某些特定基因。在目前的自体型CART生产工艺中,Kite的工艺最为简便,周期也最短,为10天左右;Novartis的生产工艺最为标准,经过后期优化后周期仍有22天;Juno的生产周期在14-18天左右。目前UCART的GMP生产周期大约为19天,其具体过程如下。

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UCART GMP生产过程

UCART初始材料:健康捐赠者细胞

首先从健康的美国捐献者血液中分离单核细胞(MNCs),这些捐献者血液来自FDA批准的,加利福尼亚州批准的,美国血库协会(AABB)认可的,临床试验标准(CLIA)认证的血库。

所有的捐献者都需要经过挑选,筛选(采集前的14天内)和检测(采集的当天)。
所有的人类细胞的捐献,获得,检测,加工和存储都遵循欧盟和美国的相关法规和指导意见。

从MNCs中分离淋巴细胞(一般的产量大于4x109 cells),一次UCART生产的初始细胞数目通常为收集到细胞的1/5-1/3(109 cells左右)。

Day1到Day4:第一次T细胞改造(慢病毒感染)

使用识别CD3/CD28的抗体偶联beads激活T细胞。
使用GMP级别的,由第三代慢病毒载体包装的慢病毒感染激活的T细胞,使得RQR8与相应的CAR在T细胞中表达。

Day5: 第二次细胞改造(TALEN介导的基因编辑)

将GMP级别的TALEN编码的mRNA通过电转转入到经过第一次改造的T细胞中,使TALEN瞬时表达。

TALEN能够识别和切割TRAC与CD52基因组DNA,形成的DNA双键裂断由非精准的NHEJ修复方式修复从而导致TRAC与CD52基因的敲除。

Day6到Day17:细胞扩增

在可控的培养系统中将细胞扩增到1011 cells左右。

Day18-19:细胞纯化与分装
使用抗体-磁珠偶联的beads,分选纯化出TCRαβ阴性的T细胞。(此为一个重要的放行标准)

细胞的分装与冻存。每个产品一般都会有2-3种剂量形式,用以满足可能的剂量递增需求。

UCART的QC标准
虽然现在还没有详尽的法规来规定CART产品的QC标准,但是CART产品还是需要一系列的质量检测。其中产品的纯度,即≥97%的TCRαβ阴性细胞是一个重要的放行标准。此外产品的无菌性,内毒素,支原体,以及是否含有可复制的慢病毒都需要进行一系列检测。产品对于目标细胞的响应(包括相关细胞因子的释放与细胞杀伤活性)也应该被检测。

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UCART的QC标准

UCART19与UCART123临床结果

在2017年12月的ASH会议上,Cellectis公布了UCART19的两个临床实验的初步结果。在CALM (UCART19 in Advanced Lymphoid Malignancies)剂量爬坡实验中,6名成人R/R B-ALL患者接受了低剂量的UCART19治疗,该剂量为自体型CART实验中剂量的1/10。实验中UCART19显示出了可控的安全性和较好的缓解率,只有一名出现了1级的GvHD。所有的6名患者都出现了细胞因子释放风暴(CRS),其中5人为轻度的1-2级,但能够通过IL6R抑制剂tocilizumab克服;其中一名患者出现了4级CRS和败血症,并在第15天后死亡。

另外的两个高剂量会在接下来的实验中进行。在PALL(Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia)实验中,5名患儿接受了固定剂量的UCART19(2x107 total cells or 1.1 to 2.3x106 cells/kg),所有患儿都在4-8天都出现了1-3级的细胞因子释放CRS,但是是可以克服的。在第28天,所有的患儿都取得了完全的缓解,但是在3个月后,两个患儿复发,并且分别在第7个月和第八个月死亡。另一个患儿死于血栓性微血管病,肾炎等移植并发症。剩下的两个患儿目前分别在移植2个月和2.5个月的缓解期。

然而UCART123的临床实验颇为不顺,在2017年9月UCART123在治疗BPDCN一期临床试验中出现了一例病人死亡,该病人在第8天经历了5级的CRS和4级的CLS,并在第9天死亡。在UCART123在治疗AML的一期临床试验中,一位病人在第9天经历了3级的CRS和4级的CLS,但最终脱离了生命危险。目前UCART123的两个临床实验已经被FDA叫停。

UCART123的安全性问题可能出在靶点CD123上,由于CD123虽然在肿瘤细胞过度表达,但正常细胞也有表达。强生和Genmab的CD123/CD3双特异抗体JNJ63709178去年发生一例严重毒副反应,临床试验被暂时叫停。Stemline的免疫毒素(CD123/白喉毒素)年初也在一个BPDCN临床试验中造成三例CLS死亡事件。

安全性问题一直是CAR-T细胞治疗中的重中之重,2017年JUNO的CAR-T产品就因为出现两次病人死亡情况被FDA叫停,从而被Novartis和Kite超越。而对于通用型CART,其面临的安全性问题压力更大,UCART123被叫停,UCART19虽然还未出现与产品相关的严重副作用,但是临床试验中也出现了多名患者死亡。因此,通用型CAR-T的设计和优化,以及临床实验中出现的CRS等都应该被小心对待。

CRISPR/Cas9与T细胞编辑

CRISPR/Cas9是现在应用最广泛,研究最深入的基因编辑工具。与TALENs和ZFNs相比,CRISRP/Cas9的精确性更高,能降低脱靶效应带来的副作用;设计简单,更利于规模化生产。虽然Novartis和Juno早在2015年就开始与CRISPR相关公司合作开发下一代CAR-T产品,但是现在还没有更多进展更新被报道。

采用CRISPR/Cas9编辑T细胞基因组是相当困难的,CRISPR/Cas9的delievry方法主要包括慢病毒,腺病毒,AAV等病毒载体递送,使用质粒或者核糖核蛋白RNP电转,或者是使用编码Cas9的mRNA与sgRNA共电转。虽然使用质粒DNA核转能够编辑T细胞基因,但是DNA核转对于T细胞的毒性非常大,不利于T细胞编辑的大规模应用。

在2015年,研究者们使用CRISPR首次成功编辑了T细胞,他们使用的是Cas9蛋白与sgRNA的RNP复合物电转,其编辑效率能够达到55%。随后研究者们使用了编码Cas9的mRNA与sgRNA共电转,其编辑效率也能够达到60%以上。虽然研究者们也成功使用了慢病毒,AAV等病毒载体递送CRISRP/Cas9进行T细胞编辑,但是其编辑效率很低。目前病毒载体在T细胞中效率低的原因还不得而知,可能的一个猜测是在T细胞中,需要快速大量的表达Cas9蛋白。

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利用不同方法递送CRISPR/Cas9进行T细胞编辑

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各种CRISRP/Cas9的递送方式在编辑T细胞时的比较

T细胞编辑的一个挑战是如何能在较短的时间窗口,完成高效的基因编辑。由于激活的T细胞比naïve T细胞更容易接受外源的核酸与蛋白质,但是多次刺激T细胞会导致T细胞衰竭,肿瘤杀伤能力降低,因此在生产T细胞产品时需要优化好实验步骤,以达到高效的编辑。目前比较通用的方法是在T细胞激活后的Day1,使用慢病毒转染表达CAR,在Day3和Day4使用RNPs或者编码Cas9的mRNA与sgRNA进行电转,最终得到的CART产品中能达到>70%的CAR转导效率与>60%的基因编辑效率。

此外,为了达到敲除多个基因的目的,使用多个sgRNA共转T细胞可能会产生较高的细胞毒性;使用Cas9 RNP多元复合物会降低细胞毒性,但是会损失一定的编辑效率。有研究者开发了One-shot CRISPR system,将多个sgRNA组装进了CAR所在的慢病毒载体中,这样就只需要在Day3单独电转Cas9的mRNA就能够达到编辑的效果,从而减少多个共转造成的细胞毒性。此外,如何提高慢病毒或者AAV递送CRISPR/Cas9编辑T细胞的效率,也是降低通用型CART生产成本,扩大生产规模的重要因素。

小结

安全性问题一直是CAR-T细胞治疗中的重中之重,通用型CAR-T面临着更大的安全性考验。在能保证安全性的条件下,通用型CAR-T与自体型CAR-T相比有着明显的优势。希望Cellectis的UCART临床实验带来更多令人振奋的结果与信息,希望CRISPR/Cas9技术能在T细胞编辑上有更大地突破,也希望CAR-T巨头和基因编辑公司的强强联合,早日为我们带来新一代的免疫细胞疗法。

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